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Bradford法蛋白定量是一种快速即用型的总量蛋白光学定量方法，在酸性条件下，考马斯亮兰G-250染料与蛋白质疏水区结合，导致最大吸收峰由465nm变为595nm，同时颜色也由棕色变为蓝色，该蓝色化合物颜色的深浅与蛋白质浓度的高低成正比关系。将蛋白质样品或稀释的BSA与Bradford试剂混合，测量在595nm处的吸收值，在建立由一系列稀释的BSA建立的标准曲线的情况下，待测蛋白质的浓度可以根据标准曲线而确定。

• 检测速度快，10～20个样品只需不足10min即可完成。
  
• 灵敏度高，最小检测蛋白量达到0.2μg，待测样品体积1～20μL。
  
• 在10～150μg/mL浓度范围内有较好的线性关系。
  
• 与还原性糖和还原性巯基试剂兼容。

• 使用前请将Bradford试剂颠倒混匀3～5次，并保温至室温后再使用。
  
• 产品中的保存条件及有效期均以未开封情况下计算，为了防止产品与空气接触发生化学反应影响产品性能，将未使用完毕的组分按存储要求保存同时建议开封后的组分尽快使用完毕。
  
• 该产品中包含配套的BSA标准蛋白溶液，由于BSA易受环境，人为，温度等因素的影响造成失效，建议收到货后将BSA溶液分成多个小管进行冷冻保存，避免反复冻融造成BSA降解失活。
  
• 样品检测后的A595值应在标准曲线范围之内，若超过此范围则需将样品酌情稀释或浓缩。
  
• 加完Bradford试剂后，须在10min内完成吸光度的测定，防止沉淀形成后影响实验结果，如果已经产生了沉淀，可以在测量前先颠倒混匀几次，可以减少误差。
  
• 进行吸光度测定时，请使用玻璃或塑料比色皿，不建议使用石英比色皿，因为考马斯亮蓝会与石英发生化学反应，长时间使用影响比色皿的透光率及使用寿命，比色皿使用后请尽快用无水乙醇冲洗干净。
  
• 所用的分光光度计需要进行预热，否则会影响结果的准确性。
  
• 由于不同蛋白光吸收值各不相同，因此如果能用目的蛋白做标准曲线可得到更正确的结果。
  
• Bradford法测定蛋白浓度不受还原试剂的影响，但是受略高浓度的去垢剂影响。需确保SDS低于0.1%，Triton X-100低于0.1%，Tween 20、60、80低于0.06%。含去垢剂的样品推荐使用百奥莱博的BCA蛋白定量检测试剂盒(货号：GS1480)或抗干扰型蛋白浓度测定试剂盒(货号：GS1485)。
  
• 测量顺序应按蛋白浓度由低到高的顺序(以避免影响结果)，或使用一次性塑料比色杯。
  
• 使用后，请旋紧瓶盖，防止溶液挥发和与空气的物质发生化学反应。
  
• 本试剂盒只能够用于体外实验，不能够用于临床、治疗和动物体内实验等，由此产生的后果，概不承担责任。

• 试剂准备
  
  • 取一定量的BSA标准蛋白(5mg/mL)，用1X PBS稀释为终浓度为0.2mg/mL。
    
  • 将样品用1×PBS做适当倍数的稀释。
    
  • 取8支1.5mL离心管，按照下表的比例分别加入各溶液，其中0号管为空白对照。
    

    管号	0	1	2	3	4	5	6	7
    1×PBS (μL)	300	285	270	240	210	180	150	75
    0.2mg/mL BSA (μL)	0	15	30	60	90	120	150	225
    BSA浓度(μg/mL)	0	10	20	40	60	80	100	150

• 分光光度法
  
  • 取20支1.5mL离心管，分为标准组和样品组。其中16支1.5mL离心管，每个标准品设置1个重复，各管分别加入100μL相应浓度的标准蛋白质溶液(0.2mg/mL)，剩余4支1.5mL离心管，分为2个重复组，重复组离心管编号相同，其中编号不同的两管加入100μL浓度不同的样品稀释液。
    
  • 各管加入1mL Bradford工作液，迅速混匀。
    
  • 室温25～30℃，反应5min后，以0号管为空白对照，在分光光度计上测各管的A595值。
    
  • 以标准组各管A595平均值为纵坐标，对应的蛋白质浓度为横坐标，在坐标纸上或Microsoft Excel软件中绘制标准曲线。
    
  • 根据两个相同样品稀释液A595值的平均值，在标准曲线上计算出该样品经过稀释后的蛋白质浓度。选择合适稀释度的样品计算最终的样品蛋白浓度，再由稀释倍数计算原样品蛋白质浓度
• 酶标板法
  
  • 选取酶标板上20个孔(容积250μL)，分为标准组和样品组。其中16个孔，每个标准品设置1个重复，各孔分别加入20μL相应浓度的标准蛋白质溶液(0.2mg/mL)；剩余4孔，分为2个重复组，重复孔编号相同。其中编号不同的两孔加入20μL浓度不同的样品稀释液。
    
  • 各酶标孔加入200μL Bradford工作液，迅速混匀。
    
  • 室温25～30℃，反应5min后，以0号管为空白对照，在酶标仪上测各孔的A595值。
    
  • 以标准组各孔A595平均值为纵坐标，对应的蛋白质浓度为横坐标，在坐标纸上或Microsoft Excel软件中绘制标准曲线。
    
  • 根据两个相同样品稀释液A595值的平均值，在标准曲线上计算出该样品经过稀释后的蛋白质浓度。选择合适稀释度的样品计算最终的样品蛋白浓度，再由稀释倍数计算原样品蛋白质浓度。